Передімплантаційна діагностика (ПГД) діагностика спадкових захворювань і еммбріонов / репродуктологія

Генетичне тестування - спосіб, який використовується для діагностики спадкових дефектів у ембріонів, отриманих шляхом екстракорпорального запліднення, до настання вагітності. Передімплантаційна діагностика (ПГД) є альтернативою амніоцентезу і біопсії хоріонічний ворсинок, після яких часто слід складне рішення про переривання вагітності, якщо результати несприятливі. На сьогоднішній день ПГД - єдино можливий варіант, що дозволяє уникнути високого ризику народження дитини з генетичними захворюваннями.

В яких випадках виконується ПГД при генетичних патологіях

Показання до предімплантаціонний діагностиці з боку генетики:
Носійство аутосомно-рецесивних захворювань;
Патологія, сцепленная з Х-хромосомою;
Пари зі значущими транслокаціями хромосом, які перешкоджають імплантації, провокують викидні або мають на увазі психічні або фізичні проблеми у потомства;
Носійство аутосомно-домінантних захворювань.

Передімплантаційної діагностика використовується при патологіях, пов'язаних зі статтю, одиночних дефектах гена і хромосомних розладів.

Порушення, пов'язані з підлогою

Зчеплені з Х-хромосомою захворювання передаються дитині через матір, яка є носієм. Патологічна Х-хромосома викликає хворобу у синів, які не успадкують нормальну X-хромосому від батька, а отримують У-хромосому. В майбутньому очікувано народження здорових хлопчиків, але ймовірність носійства у дочок становить 50%, за умови здоров'я матері.

важливо

Хвороби, зчеплені з Х-хромосомою, ніколи не передаються від батька до сина.

Аутосомно-рецесивна патологія включає гемофілію, більшість нервово м'язової дистрофії та сотні інших захворювань.

Аутосомно-домінантні розлади проявляться синдромом Ретта, псевдогіперпаратіреозом, рахіт, стійким до вітаміну Д, синдромом Блоха-Сульцбергера (спадкове порушення пігментації шкіри з патологією зорового апарату, зубів і центральної нервової системи) і ін.

У-хромосома несе незначну кількість генів, але з нею зчеплені деякі патології статевої диференціювання.

При важких формах порушення сперматогенезу (критично мала кількість або повна відсутність чоловічих статевих клітин) в 18% випадків діагностуються мікроделеції в гені фактора азооспермії, локалізованому на довгому плечі У-хромосоми.

Дефекти одного гена

ПГД застосовується для ідентифікації окремих дефектів гена, який викликає ряд захворювань:

Кістозний фіброз;
Хвороба Тай-Сакса;
Серповидно-клітинна анемія;
хвороба Хантінгтона.

При даних патологіях генетична діагностика виявляє дефект за допомогою молекулярних методів з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ампліфікації (багаторазового тиражування) ДНК з однієї клітини.

хромосомні розлади

В результаті транслокації, інверсії і делеції відбувається пошкодження хромосоми, яке може бути виявлено за допомогою флюоресцентної гібридизації. У деяких пар шанси на настання життєздатною вагітності без використання ПГД мізерно малі, так як попередні спроби приводили до зародження ембріонів з хромосомної мутацією і закінчувалися мимовільними викиднями.

Предімплантаціонний генетичний скринінг: відносні свідчення

Відповідно до проведених досліджень, більшість переривань вагітності на ранньому терміні відбувається через анеуплоїдії - порушення кількості хромосом. Так як в матку переносяться здорові ембріони, ймовірність викидня в першому і другому триместрі знижується.

В даний час немає конкретного списку показань для ПГД.

Бажаним вважається проведення передімплантаційного генетичного скринінгу в наступних випадках:

Планована вагітність у віковій жінки.
Обтяжений акушерсько-гінекологічний анамнез з неодноразовими викиднями.
Невдалі багаторазові спроби ЕКО, в тому числі способом ІКСІ.
Важкий чоловічий фактор безпліддя.

Доведений факт, що ризик анеуплоїдії збільшується з віком жінки. Хромосоми з меншою ймовірністю діляться належним чином, що призводить до додаткової або відсутньої хромосомі у ембріона. Патологічний кількість хромосом становить понад 20% у матерів у віці 35- 39 років, а у віці від 40 років і старше досягає 40%.

Частота анеуплоїдії у дітей, народжених від матерів у віці 35-39 років - 0,6-1,4%, старше 39 років - 1,6-10%.

важливо

Не всяка вагітність завершиться народженням життєздатного дитини, іноді самопрериваніе відбувається раніше, ніж жінка могла б запідозрити про свій стан.

Прикладом частою анеуплоїдії служить трисомія 21 хромосоми, яка призводить до синдрому Дауна. Проводилась оцінка частоти трисомії 21 у життєздатного плода в залежності від віку матері. За результатами, оптимальний вік для дітородіння - від 20-24 років (найнижчий ризик 1/1400). У віці від 40 - 1/100, старше 45 років - 1/25.

Повторювані викидні і ПГД-діагностика

Якщо у жінки відбувається 2 або більше послідовних переривань вагітності на терміні до 20 тижнів, цілком обгрунтовано проведення ПГД перед ЕКО. Причина часто невідома, але хромосомні аномалії у абортованих ембріонів діагностується в 50-80%.

Зверніть увагу

Проведені дослідження показали, що пари з декількома викиднями схильні до вищого відсотку анеуплоїдних ембріонів.

Невдале ЕКО кілька разів поспіль

Три і більше невдалих спроби ЕКО за участю високоякісних ембріонів можуть свідчити про хромосомних аномаліях. Крім цього, варто пам'ятати про імунологічні і маткових факторах, що сприяють порушенню імплантації.

Чоловічий фактор безпліддя

Гіпогонадизм у чоловіка призводить до утворення ембріонів з хромосомними аномаліями. У нормальній спермі присутні близько 3-8% патологічно змінених сперматозоїдів. Їх кількість значно зростає у чоловіків з важкою формою безпліддя (зменшення кількості, погана морфологія і порушення рухової активності) до 27-74%.

За допомогою інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїда в яйцеклітину погана якість сперми перестало бути перешкодою для зачаття біологічно рідну дитину. Було встановлено, що різні генетичні дефекти пов'язані з чоловічим фактором безпліддя. Найчастіше це анеуплоїдії, синдром Клайнфельтера, мікроделеції У-хромосоми, пошкодження андрогенового рецепторів і інші мутації аутосомних генів (муковісцидоз).

важливо

Під час процедури ІКСІ вимикається природний відбір, тому підвищується ризик передачі генетичних мутацій потомству.

вибір статі

ПГД може визначити стать ембріона, але бажання народити хлопчика або дівчинку без показань (генетичні хвороби, зчеплені з підлогою) не етично.

Відповідність людського лейкоцитарного антигену (HLA)

Серед нових свідчень ПГД - зіставлення HLA. Цей метод може застосовуватися для виключення генетичної патології. У ситуаціях, коли в родині вже є дитина з рецесивним захворюванням, і потрібне лікування з трансплантацією стовбурових клітин або кісткового мозку (таласемія, лейкемія), можливо вибрати "відповідний" ембріон, який після народження стане донором для пробанда (брат або сестра). Перший випадок описаний на прикладі родини з дитиною, страждаючим анемією Фанконі, а ПГД виконувалася для вибору здорового ембріона з тим же типом HLA, що і у хворого брата. Застосування ПГД в подібних ситуаціях спірно по морально-етичних причин.

Передімплантаційна діагностика: як проводиться і які є способи

Пари, що входять в зону ризику, отримують консультацію генетика, який оцінює ризик передачі генетичної патології. Проводять аналізи, які підтверджують діагноз у одного з батьків. Залежно від генетичного захворювання, вибирають метод діагностики, за допомогою якого можливо ідентифікувати зміни у ембріона.

Для отримання біоматеріалу для ПГД використовують тільки ЕКО. На третій чи п'ятий день після запліднення витягується необхідний біоматеріал. Генетичний аналіз перед пересадкою проводять з використанням полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР), флуоресцентної гібридизації (FISH), порівняльної геномної гібридизації (CGH) і NGS-тестування.

Здорові ембріони переносяться в матку (як правило, не більше 2-х), а інші піддаються вітрифікації. Швидка заморозка дозволяє використовувати їх в наступних циклах ЕКЗ.

ПЛР

ПЛР використовують для діагностики дефектів одного гена, включаючи домінантні і рецесивні розлади. ПЛР (іноді називають ампліфікація ДНК) - метод, при якому конкретна послідовність копіюється багато разів, що дозволяє провести аналіз.

Для точної діагностики необхідний високоякісний зразок ДНК, який важко отримати з однієї клітини.

Помилки в ПЛР-аналізі можуть призвести до перенесення неякісного ембріона в 11% при аутосомно-домінантною патології і в 2% при рецессивной.

Полімеразна ланцюгова реакція дозволяє уточнити діагноз, якщо є:

Дефекти одного гена при аутосомно захворюванні;
Поодинокі генні патології при чоловічому безплідді;
Ідентифікація статі при X-пов'язаних захворюваннях.

Флуоресцентна гібридизація (FISH)

FISH використовується для визначення статі для Х-зчеплених захворювань, хромосомних аномалій та анеуплоїдії.

Зонди, які представляють невеликі фрагменти ДНК, що відповідають аналізованих хромосомами, зв'язуються зі "своєю" хромосомою. Кожен зонд має свій барвник. Процес візуалізується під флюоресцентним мікроскопом. Кількість хромосом кожного кольору підраховують і роблять висновки.

Флуоресцентна гібридизація in situ обгрунтована, якщо необхідно виконати:

Анеуплоїдних скринінг у жінок старше 38-39 років;
Підрахунок кількості хромосом при чоловічому безплідді;
Ідентифікацію статі при Х-пов'язаних захворюваннях;
Діагностику батьківських транслокаций, які привели до повторних численним викиднів.

Порівняльна геномна гібридизація (CGH, РГД)

Людська клітина містить 23 пари хромосом; однак аналіз FISH дозволяє точно оцінити тільки 7-9 хромосом в кожній отриманої клітці. Отже, багато аномальних ембріони залишаються невиявленими і можуть бути використані в перенесенні.

При проведенні порівняльної геномної гібридизації тестируемую ДНК обробляють флуоресцентним барвником (зеленим), а для зразка використовують червоний колір. Потім дві клітини гібрідізіруют, а співвідношення між двома кольорами порівнюється. Якщо хромосомний аналіз показує надлишок червоного, ядро ембріона містить додаткову хромосому. Якщо виявляється надлишок зеленого кольору, то в ядрі ембріона відсутній одна з хромосом. РГД дозволяє не тільки оцінити всі 23 хромосоми, але і дає більш детальну картину довжині, що може виявляти дисбаланс хромосомних сегментів.

В даний час цей метод займає 72 години. З огляду на обмежену тривалість життя ембріонів в культуральному середовищі, необхідна вітрифікація ембріонів. Навіть при високій виживаності, криоконсервация може привести до 30% втрати життєздатних ембріонів.

Зверніть увагу

У великих репродуктивних клініках вже працюють за прискореними протоколам РГД, де результат стає відомим через 24 години, що дозволяє не пропустити оптимальний термін для перенесення.

NGS-тестування

Спосіб передбачає визначення послідовності нуклеотидів (базових структур спадкового матеріалу) в РНК і ДНК.

До переваг відносять:

можливість оцінити повноцінність / дефекти всіх хромосом;
мінімізація помилки за рахунок автоматизації процесу;
одночасне розкодування декількох секвентов;
багаторазовий аналіз локусу генетичного коду;
висока чутливість і точність;
мінімізація помилкового висновку (0,001%);
атравматичность для ембріона;
підвищення шансів на вдале ЕКО.

Абсолютні показання до NGS: носійство хромосомної аномалії у батьків або в роду, генетичні захворювання, зчеплені з підлогою.

Предімпланціонное дослідження NGS включає наступні етапи:

біопсію ембріона в стадії бластоцисти, частіше біопсірующім трофоектодерми;
виділення нуклеїнових молекул;
створення базису для подальшого генетичного тестування,
ампліфікація з отриманням амплікон ПЛР-способом, які приймаються за зразок;
комп'ютеризована візуалізація моделі первинної ДНК / РНК в результаті множинного, непаралельності аналізу фрагментів.

Спеціаліст оцінює на комп'ютері графіки, де показана патологія у вигляді провалів або піків.

На підставі NGS-тестування ембріони з низькою вітальністю або з клінічно вираженими мутаціями відбраковуються, а решта після розморожування використовуються в протоколах ЕКО.

Далеко не всі репродуктивні клініки проводять цей аналіз.

важливо

Передімплантаційна діагностика не входить до переліку послуг з обов'язкового медичного страхування і оплачується пацієнтом.

Що досліджують при ПГД

Більшість клінік проводять біопсію ембріонів на стадії дроблення, але для ПГД можна використовувати один з 3-х методів.

Біопсія полярного тіла

Спосіб підходить для виявлення генетичної патології у жінки, так як оцінюється кількість хромосом в яйцеклітині. Біопсія полярного тіла не дозволяє отримати інформацію про хромосомному будові майбутнього ембріона, так як другу половину генетичного матеріалу він отримає від батька. Цей метод використовується рідко.

Біопсія ембріона за допомогою хетчингу

Найбільш поширений метод ПГД - дослідження одного бластомера, отриманого з ембріона, що розвивається 3-го дня. Взяття бластомера - технічно складна процедура, вона проводиться за допомогою спеціального мікроскопа і мікроманіпуляторів. Мета - вилучення потрібної клітини з мінімальною травматизацією ембріона.

На 3 день розвитку ембріон складається з 6-10 клітин, перед маніпуляцією його витримують в спеціальному середовищі протягом 20 хвилин для зменшення склеювання бластомерів. Потім ембріон фіксується і створюється отвір всередині zona pellucida, що відкриває доступ до бластомер. Ця процедура називається "хетчінг" і може виконуватися за допомогою кислотного розчину, лазера або механічним способом. В отримане отвір вводять піпетку, яка фокусується на вибраному бластомер з видимим ядром. Шляхом аспірації бластомер витягають і обробляють для FISH, або для PCR (ПЛР-діагностики), в залежності від генетичної патології. Ембріон занурюють в відповідну культуральне середовище.

До недоліків способу відносять те, що ембріон може бути мозаїчним, і для генетичного аналізу є ймовірність вилучення "здорового" бластомера.

біопсія бластоцисти

Формування бластоцисти починається з 5-го дня і визначається накопиченням внутрішньої і зовнішньої клітинної маси. На цьому етапі ембріон складається приблизно з 100 клітин. Через зроблений отвір забирають клітини з трофоектодерми з використанням тонкої піпетки для біопсії. Внутрішня клітинна маса не травмується. Генетичний аналіз проводять за допомогою FISH або PCR.

Обмеження діагностичної процедури - мозаїчність ембріона і необхідний час на проведення дослідження - 24-48 годин, що значно знижує життєздатність і зриває імплантацію.

Єдиним виходом є заморозка біоматеріалу, після якої якість ембріонів страждає незначно.

ПГД в більшості випадків повинен бути завершений протягом 24 годин після виконання біопсії, що дозволяє виконати перенесення на 4 або 5 день.

Зверніть увагу

Більшість клінік проводять аналіз на 24 хромосоми (22 аутосоми і 2 статеві хромосоми) за допомогою порівняльної геномної гібридизації після досягнення ембріонами 5-денного віку.

Плюси і мінуси генетичного аналізу у 3-х денних і 5-ти денних ембріонів

триденні:

більший ризик травматизації (близько 15%, значиму роль відіграє кваліфікація ембріолога);
можливість виконання аналізу тільки на 9 хромосом, що включають тільки найпоширеніші спадкові захворювання;
ймовірність біохімічної і завмерла через патологію в недосліджених хромосомах;
мозаицизм.

п'ятиденні:

життєздатність ембріонів знижується в міру існування поза тілом матері, є необхідність очікування для виконання біопсії (ранню бластоцисту можливо піддати вітрифікації або перенести);
зупинка в розвитку "хороших" ембріонів, не пов'язана з генетичними факторами;
можливість проведення розгорнутого хромосомного аналізу;
низький ризик пошкодження ембріона (близько 5%).

важливо

Неякісні ембріони вибраковуються, якби відбувся їх перенесення, вагітність або не наступила, або закінчилася зупинкою в розвитку або самопрериваніем на ранніх термінах.

Який спосіб ПГД найкраще

Фахівці вважають, що порівняльна геномна гібридизація краще, ніж

FISH-діагностика, так як можливості методу ширше, а ризик травмувати ембріон менше. При особливості каріотипу батьків (наприклад, транслокації) є ймовірність приєднання інтерхромосомного ефекту - ризику неправильного розбіжності будь-яких хромосом, а не тільки пошкоджених і діагностованих при каріотипування у матері або батька.

До недоліків відносять необхідність кріоконсервації і велику вартість.

FISH-дослідження краще ПЛР, так як полімеразна реакція несе ризик помилкового діагнозу через біологічного забруднення.

На сьогоднішній день найефективніший метод - NGS - секвенування нового покоління.

Мішина Вікторія, уролог, медичний оглядач