Мета проведення молекулярно-генетичних методів дослідження - визначення наявності модифікацій і изме-нений в деяких хромосомах, ДНК-ділянках або генах. Широке використання на практиці цей спосіб роботи з ДНК отримав в 70-80 рр. минулого століття.
Коли призначають молекулярно-генетичні дослідження
Молекулярно-генетичні дослідження допомагають діагностувати:
- Моногенні генетичні захворювання;
- Імовірність розвитку онкологічних хвороб;
- Наявність факторів, що провокують мультифакторні хвороби.
Визначення ризику розвитку онко-процесів за допомогою молекулярно-генетичного дослідження виявляє:
- Ризик розвитку раку шлунка і щитовидної залози;
- Імовірність виникнення раку товстої кишки і ранніх стадій цього захворювання;
- Генетичну схильність до розвитку раку тіла матки, яєчників, молочної та передміхурової залози;
- Наявність рекомбінації генів ABL / BCR, що виявляються при лейкозі;
- Наявність передумов, що забезпечують ефективність протипухлинної терапії гефатінібом при наявності немелко-клітинного раку .
Проводячи молекулярно-генетичні тести на наявність генетично обумовлених передумов розвитку мультифакторних захворювань, вдається виявити ризик розвитку:
- гіпертонічної хвороби;
- прееклампсії;
- ревматоїдного артриту;
- остеопорозу;
- порушень ліпоїдного обміну;
- цукрового діабету 1 і 2 типу;
- хвороб репродуктивної системи.
За допомогою цього методу оцінюють метаболізм і виправданість застосування тих чи інших лікарських препаратів.
Кому призначають молекулярно-генетичні дослідження
Молекулярно-генетичні тести показані особам:
- страждаючим безпліддям;
- піддаються впливу несприятливих факторів навколишнього середовища;
- мають в роду близьких родичів, що страждають онкологічними, психічними, судинними і ендокринними захворюваннями.
Як проводиться молекулярно-генетичний тест
Перший етап молекулярно-генетичного аналізу дуже важливий і полягає в отри-ванні РНК і ДНК зразків, які являють собою окремі фраг-менти ДНК клітини або всю її ланцюжок. Для виділення необхідної кількості фрагментів використовують спосіб ампліфіцірованія, тобто їх розмноження шляхом полімеразної ланцюгової ре-акції (ферменту-тивная реплікація).
Для аналізу молекул ДНК потрібно їх попереднє поділ на частини і обробка бактеріальними ендонуклеаза (рестріктазамі) - ферментами, які можуть розрізати подвійну спіраль ДНК на частини по 4-6 пар.
Фрагменти ДНК розділяють по довжині і розміром за допомогою спеціального гелю (поліакріламідного і агарозного), застосовуючи електрофорез. Під дією останнього вони переміщаються вниз по гелю з різною швидкістю, залишаючи за собою дискретну смугу.
Молекулярно-генетичні дослідження спадкових патологій також ис-товують з метою вивчення людського геному. Блот-гібридизація по Саузерну дозволяє в даному випадку визначити необхідні для цього особливі фрагменти ДНК. При цьому спочатку вдаються до денатурації ДНК, в результаті чого отримують фрагменти-ти у вигляді одного ланцюжка і їх переносять на фільтр (нейлоновий або нітроцелюлозні), який замочений в буферному розчині.
Гель, на якому знаходяться ДНК-фрагменти, переносять на фільтрувальний папір з сольовим розчином (з високим% концентрації). Зверху на-кладивает по черзі нітроцелюлозний фільтр і фільтрувальна, але суха папір (для вбирання сольового розчину). В результаті одноцепочечниє ДНК залишаються на фільтрі в такому ж становищі як на гелі.
Для виявлення необхідних фрагментів проводять процедуру гібридизації ДНК з клонують-ванним його фрагментом або радіоактивного ДНК-зондом. Отриманий результат цієї процедури вияв-живається допомогою радиоавтографии, завдяки якій всі комплементарні зонди після-довательности ДНК відображаються в ві-де радіоактивної смуги.
Метод Саузерн дозволяє відтворити рестрикційну карту гено-ма людини в певній частині гена. Це дає можливість виявити наявність будь-яких дефектів в самому гені. Розроблені методи вважаються досить ефективними і дозволяють проводити надточну діагностику спадкових захворювань. З цією метою з ЕМБ-ріональних клітин, які містяться в амніотичної рідини, виокрем-ляють ДНК. В подальшому її гібрідізіруют, застосовуючи Саузерн-блот з радіоактивне-ним ДНК-зондом. В результаті дуже легко розпізнати аномальний ЕМБ-Ріон, тому що його ДНК гібрідізіруют виключно з ДНК-зондом, який є комплементарним мутантною послідовності.
Сучасна наука використовує ряд методів для виявлення мутацій. Всі вони діляться на непрямі і прямі молекулярно-генетичні методи дослідження.
Непрямі методи виявлення мутацій використовуються в разі, якщо відомо по-ложення гена на генетичній карті, але не розшифрована його нуклеотидних послідовність.
Пряма діагностика буває в кількох видах:
- секвенування. Це техніка виявлення нуклеотидної по-послідовності для визначення заміни підстав в певному фрагменті.
- Блот-гібридизація але Саузерну. Це рестріктний аналіз, за допомогою якого знаходять мутації, які мають порушення місця рес-трікціі.
- Аллелоспеціфіческая гібридизація з синтетичним зондом. Даний спосіб також дозволяє виявити в геномної ДНК мутації.
- Електрофорез двухцепочечной ДНК в гелі (Рівномірно денатурує, нейтральному). Воно являє собою розщеплення ДНК на хімічному і ферментативном рівні. У тих місцях, де непра-вильно зшиті підстави зазвичай визначають групу мутацій.
- Вивчення електрофоретичної рухливості ДНК-мутантних молекул.
- Аналіз синтезованого білка за допомогою електрофорезу. Про наявність мутацій судять по изме-рівняно рухливості білка в системі in vitro.
Також мутації діагностують за допомогою визначення поліморфних фрагментів (рестрикційних по довжині) в геномі. Для цього застосовують ту ж техніку блот-гібридизації за Саузерну.
Серед інших типів поліморфізму ДНК також виділяють мікросателіти. Вони являють собою корот-кі після-довательности ДНК (тандемно повторювані моно-, ди-, три- і тетрануклеотідние). Вони служать маркерами дефектних мутацій або маркерними локусами алельних варіантів гена в дослідженні.
Ген, який відповідальний за розвиток хореї Гентингтона, тя-желой патології, був відкритий в 1993 р При цій хворобі спостерігається зниження інтелектуального розвитку, розлад рухів ЦНС у людей після 40 років. Хвороба є спадковою і передається по аутосомно-домінантним типом, має 100% пенетрантність. Розташований ген хвороби в 4-й хромосомі, в корот-кого плечі.
Цей ген включає в себе нуклеотидну послідовність у вигляді багато-кратного повторення нуклеотиду ЦАГ. У здорових людей таких повторів в нормі 11-34, хворі хореей мають 37-86, але зазвичай 45. З цього випливає висновок, що хорея Гентингтона - це спадкова патологія з мутацією ге-на в багаторазовому збільшенні числа його копій (експансія).
Вікторова Юлія, акушер-гінеколог